1、DNA纯度在DNA样品中若含有蛋白质，或没有去除干净制备过程中所用的乙醇、EDTA、SDS、酚、氯仿和某些高浓度金属离子，均会降低限制酶的催化活性，甚至使限制酶不起作用；

2、 酶切消化反应的温度DNA消化反应的温度，是影响限制内切酶活性的一个重要因素。不同的核酸内切限制酶，具有各自的最适反应温度。多数限制内切酶的最适反应温度是37摄氏度，少数限制性内切酶的最适反应温度高于或低于37摄氏度；

3、DNA的分子结构DNA分子构型对核酸内切限制酶的活性有很大影响，如消化超螺旋的DNA比消化线性DNA用酶量要高出许多倍。有些限制酶在消化它们自己的处于不同部位的限制位点，其效率也有明显差异。限制性内切酶反应的终止，通常是采用65摄氏度条件下温浴5分钟。