在线粒体中通过氧化磷酸化由ATP合成酶合成，或者在植物的叶绿体中通过光合作用合成。ATP合成的主要能源为葡萄糖和脂肪酸。每分子葡萄糖先在细胞质基质中由酶催化产生2分子丙酮酸同时产生2分子ATP和4个还原性氢，产生的能量可以使2分子ADP与磷酸结合生成ATP。最终在线粒体中通过三羧酸循环产生最多38分子ATP。