核酸加热到一定温度就会两条链分开，让总核酸中有一半的核酸两条链都分开的温度就是核酸的退火温度。

退火温度是指引物和模板结合时候的温度参数，当百分之50的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。它是影响PCR特异性的较重要因素。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火， 同时还要足够高，以减少非特异性结合。