主要考虑是否在模板稀释过程中出现问题，是否存在高浓度样品污染低浓度样品的情况。具体的要看扩增曲线、溶解曲线以及标准曲线的结果才能判断。其次题主提到的两个问题：

模板浓度过高会抑制PCR反应，可能会导致扩增效率降低。但同时可能会出现非特异性扩增导致结果的Ct值不可信，最终导致扩增效率不可信。在一定范围内提高退火温度不会太影响扩增效率。