线粒体基质在内膜里。线粒体基质-内膜和嵴包围着的线粒体内部空间，含有很多蛋白质和脂类，催化三羧酸循环中脂肪酸和丙酮酸氧化的酶类，也都存在于基质中。

线粒体基质是线粒体中由线粒体内膜包裹的内部空间，其中含有参与三羧酸循环、脂肪酸氧化、氨基酸降解等生化反应的酶等众多蛋白质，所以较细胞质基质黏稠。苹果酸脱氢酶是线粒体基质的标志酶。线粒体基质中一般还含有线粒体自身的DNA(即线粒体DNA)、RNA和核糖体(即线粒体核糖体)。